公司動(dòng)態(tài)

預(yù)反應(yīng)體積與反應(yīng)體積之差稱為死體積（dead volume）^【1】，其中預(yù)反應(yīng)體積是指分區(qū)之前準(zhǔn)備的初始體積，包括master mix、引物、探針以及待檢測(cè)樣本；反應(yīng)體積是指被檢測(cè)到的分區(qū)總體積n×Vp，n為分區(qū)總數(shù)，Vp為分區(qū)體積。

死體積一般是在分區(qū)過程中產(chǎn)生，如制備過程移液步驟過多、復(fù)雜管路設(shè)計(jì)、分區(qū)過程的擠壓設(shè)計(jì)、分區(qū)后的穩(wěn)定性等，有一些儀器的檢測(cè)過程也會(huì)降低樣品的利用率。

任何生物分析都存在二次抽樣誤差，只有部分樣品被分析而不是全部，導(dǎo)致重復(fù)檢測(cè)之間的統(tǒng)計(jì)差異。例如血液樣本處理量可以達(dá)到幾毫升，而dPCR檢測(cè)體系一般只有幾十微升。二次抽樣是一個(gè)不可避免的誤差來源，尤其是在樣品中目標(biāo)分子很少的情況下。由二次抽樣引起的檢測(cè)誤差可以由以下公式（1）進(jìn)行計(jì)算^【2】，其中m是二次取樣中目標(biāo)分子的數(shù)量，對(duì)于95%的置信度，Zc應(yīng)為1.96。

                                （1）

死體積的存在導(dǎo)致dPCR運(yùn)行過程中對(duì)樣品進(jìn)行再次抽樣，其引起檢測(cè)結(jié)果的影響可參考二次抽樣誤差計(jì)算。A. Lievens等人也模擬了不同樣品利用率和各種λ值的情況下再次抽樣對(duì)結(jié)果誤差的影響^【3】。

            圖1 樣本利用率與檢測(cè)誤差率的關(guān)系

            圖片來源：羅氏診斷整理

圖1縱坐標(biāo)表示誤差超過25%的結(jié)果比例，橫坐標(biāo)表示用于分析的樣本比例，圖1的A中：藍(lán)色表示目的基因λ=0.003，紅色表示目的基因λ=0.015，黃色表示目的基因λ=0.03；圖1的B中：藍(lán)色為目的基因λ=0.001，紅色為目的基因λ=0.005，黃色為目的基因λ=0.01。結(jié)果表明絕對(duì)誤差超過25%的結(jié)果比例與樣品利用率成負(fù)相關(guān)，既死體積越大，出現(xiàn)誤差偏高的機(jī)率越大。

從一個(gè)簡單的例子可以進(jìn)一步解釋死體積對(duì)dPCR檢測(cè)結(jié)果，尤其是低拷貝模板的檢出率的影響。

如圖2^【4】所示：在不存在死體積的情況下，樣本拷貝數(shù)為15，分區(qū)數(shù)量為15。如死體積率為5%，有效分區(qū)數(shù)約為14~15，樣品檢出率在12~15拷貝之間；如死體積率為25%，有效分區(qū)在11~12，樣品檢出率在4-15拷貝；死體積率為50%，則有效分區(qū)數(shù)為7~8，樣品檢出率為2~13拷貝。死體積率越高，檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性越低，檢出限（LOD）也隨之降低，這一效應(yīng)在低拷貝樣品中尤其明顯。

                           圖2 dPCR分區(qū)

圖片來源：Journal of Food Protection, Vol. 74, No. 9, 2011, Pages 1404–1412.

與qPCR相比，dPCR檢測(cè)過程需要經(jīng)過分區(qū)這個(gè)過程，死體積率的出現(xiàn)不可避免，但死體積率與檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和檢出限成負(fù)相關(guān)，尤其是在檢測(cè)低拷貝樣品時(shí)需要重點(diǎn)關(guān)注dPCR系統(tǒng)的死體積率，盡可能選擇死體積率低的系統(tǒng)，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。